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          多功能电融合仪 | 四倍体胚胎制作及原生质体融合

          信息来源:www.forest-golf.com  |   发布时间:2022年02月14日


          细胞融合/

          核移植/

          卵子活性/

          基因组编辑

          产品主要特点:

          1.一款带有基因编辑模式应用的细胞融合仪2.高效高通量CRISPR/Cas9技术的受精卵基因编辑3.阻抗值测定功能:实际样品和缓冲液的电阻测定,可达到39.99KΩ4.超短切换时间,交流/直流切换时间小于5μs,提高融合效率5.交流电压恒定功能:即使在电阻变化时,仍可保持电压的恒定6.两种DC脉冲波形输出方式,正向脉冲/极性交替脉冲,比仅仅正向脉冲提高融合效率30%7.“Post”融合功能,细胞损伤修复功能,极大提高成活率


          产品应用:

          1.细胞融合(单克隆抗体制备)2.胚胎活化的体细胞核移植3.四倍体(Tetraploid)胚胎制作4.CRISPR/Cas9技术的受精卵基因编辑5.原生质体融合


          应用实例1

          四倍体(Tetraploid)胚胎制作

          链接:

          https://doi.org/10.1186/s13059-020-01991-8 (IF:10.124)


          摘要:

          表观遗传修饰,包括DNA甲基化,在基因沉默和基因组稳定性中起着重要作用。表观遗传失调可导致多种疾病,如癌症、肥胖、糖尿病、自闭症和印记障碍。
          印记障碍Silver-Russell综合征(SRS)是一种临床和遗传异质性疾病,其特征在于胰岛素样生长因子2(Igf2)基因表达减少引起的严重的宫内和产后生长迟缓。患有这种疾病的婴儿出生体重低,往往无法以预期的速度生长和增加体重。大约35-50%的SRS患者显示H19和Igf2基因(H19差异甲基化区域:H19-DMR)在父系等位基因中。Igf2和H19是相互印迹的基因,受H19-DMR的DNA甲基化调节。Igf2仅从父系等位基因中表达,H19仅从母系等位基因中表达。H19-DMR含有4个用于结合CTCF的高度保守的富含CG的重复位点(m1-m4),其具有甲基化敏感的增强子阻断活性。在父系等位基因中,CTCF结合位点内CpG的甲基化消除了CTCF结合并导致增强子阻断活性的丧失,从而允许Igf2表达。相比之下,SRS中父系H19-DMR的低甲基化允许CTCF结合,这导致H19的双等位基因表达,Igf2的下调,从而减缓生长。
          dCas9是Cas9的核酸酶失活变体,用于CRISPR / Cas9系统中的位点特异性靶向,而SunTag是一种含有肽表位的蛋白质支架,能够通过特定的单链可变片段(scFv)抗体招募到效应域。携带SunTag的dCas9将含有10-11转位(TET)1羟化酶的催化结构域(CD)的scFv-green荧光蛋白(GFP)-TET1CD融合蛋白招募到靶位点,导致靶向DNA去甲基化。


          本文通过四倍体互补法生成表观基因组编辑的小鼠,该方法可以生成由胚胎干细胞衍生的小鼠。将小鼠胚胎干细胞(ESC)与靶向H19差异甲基化区域(H19-DMR)的表观基因组编辑载体瞬时转染,将表观基因组编辑的ESCs或未经处理的对照ESCs引入四倍体囊胚的胚泡腔中,将这些胚胎转移到假怀孕雌性的子宫角中,然后恢复新生小鼠,以实现H19-DMR的目标去甲基化和Igf2基因的抑制。

          四倍体胚胎互补技术

          将两细胞胚胎放在含有0.5mM CaCl2和0.1 mM MgSO4的甘露醇(0.3M)培养基中洗涤,转移到电极室(LF501PT1 10,BEX)填充5 μl甘露醇培养基,连接CFB16-HB电融合仪(BEX),10 V通电2 s,使胚平行于电极;200 V通电40 μs,使胚融合。电融合后,将胚胎在37°C下在5%CO2下返回M16培养基中,成功融合的胚胎培养到囊胚阶段。利用微操纵器将10-15个表观基因组编辑的胚胎干细胞(C57BL/6Jx129X1/ svJJmsSlc)或对照野生型胚胎干细胞注入四倍体胚泡囊胚腔,实现四倍体互补。在交配2.5天后,注射的囊胚被转移到假怀孕的ICR雌鼠的子宫角。


          应用实例2

          原生质体融合(微生物基因重组)

          链接:

          https://doi.org/10.1186/s13068-019-1631-4 (IF:5.096)


          摘要:

          糠醛和乙酸是木质纤维素预处理和水解过程中产生的两种主要抑制剂,会严重抑制移动发酵单胞菌的细胞生长、代谢和乙醇发酵效率。
          基因组重排是一种快速表型改善的强大技术,它通过原生质体融合重新组合所选多亲本菌株的全基因组。经典的诱变方法需要长时间的连续筛选,很少获得具有多种优异性状的菌株,并且在重复的诱变后,在生产方面几乎没有改善。
          经过基因组重组的多次迭代后,基因组重排消除了负突变,提高了生产力,从而大大弥补了经典诱变方法的缺陷。在链霉菌中进行两轮基因组重排增加了抗生素泰乐菌的产生,相比之下,这种增加需要20轮经典菌株改进(CSI)。经过五轮基因组重排,乳酸菌不仅耐酸性(pH 4.0)强了,而且产生的乳酸比野生型多三倍。三种不同的诱变剂提高了两轮基因组重排后,从亲本菌株获得的碱性芽孢杆菌菌株中四种脂肽的产量,筛选出产脂肽的高产菌株(179.22 mg/L)。此外,基因组重排广泛应用于酿酒酵母、乙酰丁酸梭状芽胞杆菌和德尔布氏乳杆菌。
          在本研究中,成功地应用了原生质体电融合介导的基因组重组,分别从先前生成的乙酸和糠醛耐受性Z.mobilis菌株AQ8-1和F34中产生重组物,提高了Z. mobilis对木质纤维素水解物中存在的两种抑制性副产物的耐受性。


          原生质体电融合

          将AQ8-1和F34(各500.0 μL)的原生质体混合并以3000×g离心5分钟。使用SMM缓冲液洗涤沉淀物两次,然后重悬于含有0.5M山梨醇和0.2mM CaCl2的新鲜制备的电极缓冲液中将悬浮液(20.0 μL)置于单独的平行电极之间,并使用CFB16-HB电融合仪(BEX)进行电融合。


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