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          超微量—细菌群落特征评估

          信息来源:www.forest-golf.com  |   发布时间:2021年12月13日

          使用便携式纳米孔测序仪评估具有全长 16S rRNA 基因的细菌群落特征的 PCR 条件

          2014 年,Nanopore MinION测序仪(Oxford Nanopore公司,伦敦,英国)被开发出来,现在被认为是 DNA 测序的突破。它包含几个有趣的功能,可以对任何遗传材料进行实时、现场分析。该设备已在各个领域以多种方式使用,包括抗药性基因分析和评估雨林中爬行动物和两栖动物生物多样性的快速增长。MinION开始被更频繁地使用,其测序质量一直在提高,一维测序中的测序读取准确度更高 (94%)。这些基于MinION的基因测序技术比以往任何时候都更快、更容易地提供了对微生物群落结构的新见解。环境中微生物组成定量评价方法的优化、建立和标准化是不可避免的。这将使科学家能够准确回答微生物生态学的基本问题:环境中存在什么样的微生物以及有多少微生物。

          细菌群落结构的基于PCR16S rRNA分析受PCR相关条件的偏差影响。这些包括模板浓度、DNA聚合酶选择、使用的循环数、扩增反应时间和反应温度。细菌群落也可以通过只收集从宏基因组中获得的16S rRNA序列来重建,从而避免PCR偏差;然而,无PCR文库需要相对大量的输入DNA,对于许多样本类型来说是不切实际的。因此,在微生物群落分析中,具有成本效益的标记基因扩增子测序通常优于宏基因组测序,因为它可以评估不可培养的生物。

          基于此背景So Fujiyoshi[1]作者欲通过三种方法评估MinION PCR条件:(1) 对来自单一细菌物种的全长细菌16S rRNA基因进行测序,以检查生物信息学管道;(2)在五种不同的PCR条件下,对三种不同类型细菌模拟群落DNA的全长细菌16S rRNA基因扩增子进行测序;(3) 对来自六个环境样本的全长16S rRNA基因的扩增子进行测序,以将结果与使用MiSeq测序的细菌16S rRNA V3-V4区域的结果进行比较。

           

           

          摘要

          MinION是一种便携式纳米孔测序仪,于 2014 年作为一种新的 DNA 测序技术推出。MinION 因其相对于现有 DNA 测序仪的低初始启动成本、良好的便携性、易于操作、实时分析和长读长输出而被广泛使用。然而,用于基于16S rRNAPCR的实验条件的差异可能会影响样本中的细菌群落评估。因此,需要有关可靠实验条件的基本知识,以确保正确使用该技术。我们的研究涉及使用MinION为细菌群落结构评估获得准确和定量的全长16S rRNA扩增子测序数据的技术的可靠性。我们使用三个独立的模拟微生物群落标准DNA比较了五个PCR条件,并在试验中建立了适当、标准化、更好的PCR条件。然后,我们使用 Illumina MiSeq对两个模拟群落和六个环境样本进行测序以进行比较。修改PCR条件提高了测序质量;优化条件为95 °C 1 min60 °C 1 min68 °C 3 min35个循环。我们的结果为研究人员使用MinION准确确定细菌群落提供了重要信息。

           

          方法&结果

          样品和 DNA 制备

          Taichiro Takemura博士(日本长崎大学)提供的来自霍乱弧菌DNA的全长细菌16S rRNA基因用于检查生物信息学管道。PCR 条件评估最初使用参考基因DNA(Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA; https://www.zymoresearch.com)。ZymoBIOMICS 微生物群落DNA标准(ZymoBIOMICS 目录 # D6305)包含从八种细菌和两种真菌菌株的纯培养物中分离的基因组 DNA 的混合物,并提供了来自每个生物体的等摩尔量的16S rDNA。检查模拟社区DNA样品(10株均匀混合基因组材料(MSA-1000)和20株均匀混合基因组材料(MSA-1002);美国典型培养物保藏中心(ATCC),马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)的PCR条件作为以及日本的环境生物膜和水样(即淋浴喷头内部、浴缸入口和淋浴喷头供水)。如前所述用拭子收集生物膜样品使用 50 毫升注射器(Terumo公司,日本东京)和0.2微米滤筒(SterivexMilliporeMAUSA)现场过滤两升喷头进水。立即将样品放入冷箱中,带到实验室并保持在- 20 °C。使用 DNeasy PowerBiofilm KitQIAGENGermantownMDUSA)从这些样品中提取DNA,稍加修改。使用Dr. GenTLE 沉淀载体(Takara Bio Inc.)纯化和沉淀后,将提取的DNA保持在- 20 °C。使用光谱/荧光计(DS-11FX+DeNovixWilmingtonUSAQuantiFluor dsDNA 系统(PromegaMadisonWIUSA)测定提取的DNA制剂的浓度和纯度。

           

          PCR条件

          聚合酶扩增效率最初使用从浴室收集13个生物膜和水样进行检查。测试了五种不同的 DNA 聚合酶,MightyAmp DNA聚合酶v.2Takara Bio Inc.)在我们评估中使用的其他聚合酶中提供了最高的扩增效率,如先前其他地方报道的。PCR使用对文库制备试剂盒(SQK-RAS201SQK-RAB204Oxford Nanopore Technologies)中包含的16S rRNA基因靶向序列特异的引物对(27F1492R)进行。第一个PCR条件 (T0) 包括在98°C下预热2分钟,在98°C下进行10秒、60°C15秒和68°C2分钟的35个循环。表中列出了每个步骤持续时间的替代 PCR 条件 (T1–T4)。使用 T0 条件对霍乱弧菌DNA进行PCR表格1显示了与 ZymoBIOMICS 模拟社区样本一起使用的四种不同的PCR条件 (T1–T4)ATCC模拟社区和环境来源的样品使用两种不同的 PCR 条件(T0T4)进行扩增。扩增片段在2%琼脂糖凝胶上分离,用 Safelook Load-GreenWakoOsaka,日本)染色,并在 FAS Nano Gel Document SystemNippon Genetics东京日本)上可视化。

           

          1 长度修整对霍乱弧菌数据的影响。

           

           

          2 使用模拟社区比较五种 PCR 条件。使用 Illumina Miseq (2 × 150 bp) 通过霰弹枪测序评估理论值。

           

           

          3 使用MinIONT0T4条件下与MiSeq比较模拟1020样品的细菌群落组成。使用Illumina平台通过全基因组霰弹枪测序评估模拟ATCC 1020的理论值。

           

           

          4 使用MinIONT0T4条件下与MiSeq比较环境来源样品的细菌群落组成。列出前 15个最丰富的属。

           

          纳米孔测序文库构建

          30 μl Agencourt AMPure XP 磁珠(Beckman Coulter,东京,日本)纯化PCR产物(每个50 μl)后,用10 μl缓冲溶液(10 mM Tris-HCl pH 8.0,含50 mM NaCl) 洗脱DNA,使用光谱/荧光计 (DS-11FX+, DeNovix) QuantiFluor dsDNA 系统 (Promega) 测定其数目和纯度。纯化的扩增子 DNA10050 fmol)用作MinION兼容文库的输入DNA。将扩增子加入1 μl快速接头 (Oxford Nanopore Technologies) 并在室温下孵育所需的时间。

           

           

          纳米孔测序和碱基识别

          在进行平台质量控制分析后,纳米孔测序文库在FLO-MIN106 R9.4流动池上单独运行。扩增子文库 (11 μl) 用含有3.5 μl无核酸酶水和25.5 μl上样珠的运行缓冲液 (35 μl) 稀释。使用MinION控制软件MinKNOWv. 1.6.1-1.10.23 启动48小时测序方案。使用Albacore v. 1.2.1v. 2.1.3软件(Oxford Nanopore Technologies)将MinION序列读数(即fast5数据)转换为fastq文件,并使用平均质量得分超过7的阈值进行过滤。图5显示研究的工作流程。